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一、目的基因的確定
1. 檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）。
2. NCBI查閱
3. 搜索引擎輔助
二 、設(shè)計siRNA靶序列
在制備siRNA 前都需要單獨設(shè)計siRNA序列.研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細胞,*有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴謹，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。
1. 選擇siRNA靶位點
從轉(zhuǎn)錄AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。
2. 序列同源性分析
將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人或者小鼠、大鼠等等）進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標序列進行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果,因此對于一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設(shè)計siRNA。
通常來說，每個目標序列設(shè)計3-4對siRNAs，選擇*有效的進行后續(xù)研究。
3. 設(shè)計陰性對照
一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。
三、表達載體的選用
1. 化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導(dǎo)入細胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：siRNA進入細胞后容易被降解；進入細胞siRNA在細胞內(nèi)的RNAi效應(yīng)持續(xù)時間短.針對這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達。該方法的基本思路是：將siRNA對應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子后，這樣就能在體內(nèi)表達所需的siRNA分子。這種方法總體的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA，能達到較長時間的基因沉默效果。
2. 通過質(zhì)粒表達siRNAs大都是用Pol III啟動子啟動編碼shRNA(small hairpin RNA)的序列。選用Pol III啟動子的原因在于這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4—5個連續(xù)的U即終止，非常**。當這種帶有Pol III 啟動子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞時，這種能表達siRNA的質(zhì)粒確實能夠下調(diào)特定基因的表達，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點在于，通過siRNA表達質(zhì)粒的選擇標記，siRNA載體能夠更長時間地抑制目的基因表達。當然還有一點，那就是由于質(zhì)粒可以復(fù)制擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。
3. 帶有***標記的siRNA表達載體可用于長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質(zhì)粒可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達數(shù)星期甚至更久。同時RNAi-Ready表達載體還能與逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒表達系統(tǒng)整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表達載體對宿主細胞的侵染性,徹底克服某些細胞轉(zhuǎn)染效率低的障礙，是實現(xiàn)哺乳動物細胞siRNAs瞬時表達與穩(wěn)定表 達的理想工具。
四、合成模板
1. 合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點，同時兩端分別設(shè)計 BamH I 和 Hind III 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamH I 和 Hind III 酶切位點之間。
2. 95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。
五、連接與轉(zhuǎn)化
1. 將100 μl感受態(tài)細胞于冰上解凍。
2. 取5 μl連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物，在冰上放置30分鐘。
3. 將管放入預(yù)加溫到42℃的水浴中，熱激90秒。快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1~2分鐘。
4. 每管中加700 μl LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，進行復(fù)蘇。
5. 室溫4 000 rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100 μl培養(yǎng)基重懸細胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細胞的效率進行調(diào)整。
6. 將平板置于室溫直至液體被吸收。
7. 倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16小時后可出現(xiàn)菌落。
六、PCR鑒定和測序鑒定
在插入編碼shRNA的DNA雙鏈模板兩側(cè)設(shè)計鑒定PCR引物，擴增片段在100-200，bp之間。
收起
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